Техніка пункції кісткового мозку та біопсії у не-людських приматів: фокус на застосуванні біопсійної голки

Не-людоподібні примати (NHP) є основними експериментальними тваринами для доклінічних гематологічних досліджень, розробки ліків зі стовбурових клітин, дослідження імунних механізмів і досліджень трансляційної медицини. Висока-якість, низька-контамінація та повні зразки кісткового мозку є передумовою та основою надійних експериментальних даних. Пункція кісткового мозку та біопсія серцевини є найпоширенішими методами взяття зразків кісткового мозку in vivo для приматів, не-людей. На відміну від звичайного збору венозної крові, ця технологія покладається на використання професійних твердих порожнистих голок для біопсії для проникнення в кортикальну кістку довгих і плоских кісток і отримання якісної рідини кісткового мозку та інтактних тканин серцевини кісткового мозку з медулярної порожнини. Вся операція значною мірою залежить від технічних характеристик, відповідності моделі та стандартизованого застосування голок для біопсії кісткового мозку. У поєднанні з протоколами зрілих експериментів на тваринах і літературним досвідом ця стаття систематично розробляє повні-технічні характеристики процесу пункції та біопсії кісткового мозку NHP, зосереджуючись на характеристиках вибору, перевагах застосування та стандартизованих основних принципах роботи спеціальних біопсійних голок, щоб забезпечити стандартизовані технічні вказівки для дослідників-експериментаторів.

Основний технічний принцип пункції та біопсії кісткового мозку у приматів, не-людей, узгоджується з класичною системою взяття зразків кісткового мозку собак (Crow et al., 2009). Основна логіка полягає у використанні жорстких порожнистих голок для біопсії, щоб пробити бар’єр твердої кортикальної кістки, точно визначити місцезнаходження медулярної порожнини та отримати рідину кісткового мозку та зразки твердого ядра за допомогою аспірації під негативним тиском і ротаційного різання. Згідно з анатомічними характеристиками NHP, загальні місця взяття зразків поділяються на зони передніх і задніх кінцівок. Пріоритетні місця відбору зразків задніх кінцівок включають гребінь клубової кістки та вертлужну ямку стегнової кістки (Wolf & White, 2012), які підходять для більшості моделей приматів середнього та великого-розміру; альтернативним місцем для передньої кінцівки є великий горбок плечової кістки з неглибоким анатомічним положенням і зручним керуванням, придатним для додаткового відбору проб і повторних експериментів. Різні місця взяття зразків мають відмінності в товщині кістки, діаметрі медулярної порожнини та охопленні м’яких тканин, які необхідно узгодити з відповідними специфікаціями голок для біопсії кісткового мозку, щоб забезпечити ефективність взяття зразків і якість зразка.

Будучи інвазивною операцією на кістках, пункція кісткового мозку та біопсія NHP викличуть певну стимуляцію тканин і реакцію болю. Для забезпечення добробуту тварин і стабільної експериментальної роботи всі операції з відбору зразків повинні проводитися під стандартизованою анестезією. Дослідники можуть вибрати загальну анестезію або місцеву цілеспрямовану анестезію відповідно до експериментального циклу, частоти відбору проб та індивідуального стану тварини, щоб досягти достатньої інтраопераційної та післяопераційної аналгезії. Крім того, увесь процес має суворо відповідати стерильним експериментальним специфікаціям, включаючи передопераційне гоління та підготовку шкіри області взяття зразків, багато-стандартну дезінфекцію повідон-йодом і спиртом, укладання стерильного рушника та носіння стерильних рукавичок і хірургічних інструментів, щоб ефективно уникнути локальної інфекції, запалення рани та інших післяопераційних ускладнень, які впливають на подальші повторні експерименти.

Класифікація, вибір та переваги ефективності спеціальних голок для біопсії кісткового мозку

Голка для біопсії кісткового мозку є основним прецизійним інструментом для взяття зразків кісткового мозку NHP, який визначає частоту успіху-разової пункції, цілісність зразка та ступінь забруднення периферичної крові. На даний момент існує кілька зрілих комерційних моделей спеціальних голок для взяття зразків кісткового мозку для експериментальних тварин, включаючи голку Rosenthal, Klima, голку для грудини/клубової кістки штату Іллінойс та голку Jamshidi. Кожна модель має диференційовану конструкцію за довжиною голки, діаметром, внутрішньою структурою серцевини та рукояткою, що адаптується до різних типів тіла тварин, анатомічних характеристик кісток та цілей експериментального відбору зразків.

Серед усіх типів голок,Голка для біопсії кісткового мозку 14G Jamshidiє золотим стандартом для біопсії кісткового мозку NHP, що є найбільш рекомендованою специфікацією для експериментальних операцій. Цей тип біопсійної голки має оптимізовану жорстку порожнисту структуру з відповідним центральним суцільним стилетом. Тіло голки має помірну твердість і в'язкість, що може ефективно проникати в кортикальну кістку приматів, не згинаючись і не ковзаючи. Спіральна ріжуча кромка на кінчику голки може стабільно вбудовувати та перехоплювати цілі тканини серцевини кісткового мозку, уникаючи фрагментації зразка та пошкодження екструзією тканини, спричиненого непрофесійними типами голок. Порівняно з тонкими-аспіраційними голками, біопсійна голка 14G Jamshidi має більший внутрішній діаметр порожнини, завдяки чому можна отримати достатній-об’єм кернових зразків, забезпечуючи при цьому безпеку, відповідаючи потребам морфологічного виявлення, розрізу тканини та експериментального аналізу індексу кернової біопсії. Порівняно з великими товстими голками, він може ефективно зменшити надмірну травму кістки та інтраопераційну кровотечу, збалансовуючи якість зразка та повторне використання тваринами.

Усі спеціальні голки для біопсії кісткового мозку мають відповідний центральний стилет, що є ключовою структурною особливістю, відмінною від звичайних ін’єкційних голок. Стилет може повністю заблокувати порожнисту порожнину тіла голки під час проколу, запобігти потраплянню м’яких тканин шкіри та кісткових уламків у порожнину голки, щоб заблокувати трубопровід, і забезпечити плавний хід подальшої аспірації під негативним тиском і розрізання основної тканини. Під час повторних експериментів із відбором зразків дослідникам потрібно вибрати специфікації голок відповідно до маси тіла тварини та розміру кісток: короткі й тонкі-голки для біопсії для дрібних приматів (маса тіла менше 5 кг) і звичайні голки Jamshidi середньої-довжини 14G для середніх і великих особин, забезпечуючи точне підключення обладнання та експериментальних об’єктів.

Основні передопераційні запобіжні заходи під час взяття біопсійної голки

Щоб уникнути коагуляції зразка, гемолізу та контамінації, а також підвищити кваліфіковану швидкість експериментальних зразків, стандартизовані специфікації попередньої обробки та роботи для біопсійних голок повинні бути застосовані перед взяттям зразків. по-перше,гепаринова антикоагулянтна попередня обробка голок і шприцівє обов'язковим. Перед використанням витягніть невелику кількість розчину гепарину, щоб промити внутрішню стінку голки для біопсії та відповідного шприца, і повністю видаліть залишкову рідину, утворюючи рівномірне антикоагулянтне покриття гепарину на внутрішній стінці порожнини голки. Ця операція може ефективно запобігти швидкому згортанню рідини кісткового мозку після взяття зразка, уникнути збою підготовки мазка та виявлення клітин, спричиненого коагуляцією зразка, і є ключовим етапом попередньої обробки для отримання високо-якісної рідини кісткового мозку.

По-друге, для довготривалих-експериментів із повторним відбором зразків на тваринах,ротаційний вибір місць пункціїслід застосувати, щоб уникнути повторної пункції в одному місці, що може призвести до гіперплазії кортикальної кістки, локальної адгезії тканин і підвищення резистентності до проколу, що призведе до невдалого взяття зразка та збільшення травм тварин. З точки зору схеми знеболювання, місцева ін’єкція анальгетика в шкіру та глибокі м’які тканини місця проколу перевершує просту загальну анестезію, яка може ефективно полегшити післяопераційну хворобливість і дискомфорт, зменшити реакцію тварини на стрес і полегшити післяопераційне відновлення та наступні повторні експерименти.

З точки зору контролю об’єму зразка, обмеженого ємністю порожнини голки для біопсії та фізіологічним об’ємом крові піддослідних тварин, об’єм зразка з одного місця пункції не повинен перевищувати 2 мл. Надмірна екстракція призведе до значного розведення периферичної крові, зменшить частку ядерних клітин і активних тканин кісткового мозку в зразку, заважатиме результатам експериментального виявлення та вплине на точність аналізу гематологічного індексу та морфологічного спостереження тканин.

Стандартна операційна процедура для пункції гребеня клубової кістки (операція стрижневої біопсійної голки)

Гребінь клубової кістки є найбільш звичайним і бажаним місцем взяття зразків для біопсії кісткового мозку приматів, відмінних від людини, з товстою кортикальною кісткою, багатою кровотворною тканиною медулярної порожнини та кількома прилеглими важливими органами, що характеризується високою безпекою та високим рівнем успіху. Після того, як тварина буде повністю анестезована, покладіть її в положення лежачи, підігніть обидві нижні кінцівки під животом, щоб підняти тазостегнову кістку та повністю відкрити зону взяття зразка гребеня клубової кістки. Більшість не-приматів мають рідкісне волосся в області гребеня клубової кістки, яке потребує лише простого гоління та підготовки шкіри. Шкіру дезінфікують почергово повідон-йодом і спиртом і накладають стерильний рушник для ізоляції операційної зони та забезпечення стерильності операції.

Підтвердивши межі гребеня клубової кістки пальпацією, зробіть невеликий розріз шкіри стерильним хірургічним лезом на передній стороні гребеня клубової кістки, щоб зменшити опір тертю біопсійної голки під час проникнення. Вирівняйте біопсійну голку 14G Jamshidi з розрізом, повільно просуйтеся до переднього дорзального краю гребеня клубової кістки, весь час тримайте тіло голки перпендикулярно до площини гребеня клубової кістки та застосовуйте постійний і стабільний тиск вниз, обертаючи тіло голки за годинниковою стрілкою. Вертикальна позиція введення голки є ключем до успішної біопсії, яка може забезпечити точне входження кінчика голки в мозкову порожнину, уникнення косого проникнення, що призводить до розщеплення кортикальної кістки та пошкодження прилеглих тканин, а також максимізацію продуктивності різання та взяття зразків кінчиком біопсійної голки.

Коли тіло голки проникає в кортикальну кістку, оператор, очевидно, відчує раптове зниження опору проникненню, і голка для біопсії може бути стабільно зафіксована в кістковій тканині без тремтіння, що вказує на те, що кінчик голки успішно увійшов у медулярну порожнину. У цей час повністю витягніть центральний стилет, приєднайте стерильний шприц на 10 мл до хвоста біопсійної голки та застосуйте стабільний негативний тиск, потягнувши за поршень. Свіжий кістковий мозок приматів темно-червоний і пінистий, має вищу в’язкість, ніж периферична кров, і містить крихітну трабекулярну кісткову тканину світлого-кольору, яка є кваліфікованим зразком кісткового мозку.

Якщо рідина кісткового мозку не витягнута, не витягуйте голку наосліп. Поверніть голку для біопсії на 90–180 градусів, щоб відрегулювати діапазон різання та взяття зразка кінчика голки; якщо все ще не працює, знову вставте стилет, трохи відрегулюйте глибину тіла голки вперед або назад і знову застосуйте негативний тиск. Для діагностичних експериментальних зразків об’єм зразка з одного місця контролюється в межах 1 мл, щоб забезпечити чистоту зразка; якщо для експериментів необхідний великий об’єм зразків кісткового мозку, для взяття зразків слід вибрати кілька місць пункції замість надмірного вилучення в одному місці. Після взяття зразка швидко витягніть голку для біопсії, нанесіть прямий компресійний гемостаз на місце пункції на тривалий час і зашийте шкіру однонитковим швом, якщо виникає кровотеча.

Операція пункції та біопсії стегнової вертлюгової ямки та проксимального кінця плечової кістки

Трохантерна ямка стегнової кістки є ідеальним додатковим місцем взяття проб для не-приматів малого розміру (маса тіла<5kg). The local bone structure is shallow, and the medullary cavity is concentrated, which is convenient for the positioning and penetration of fine-gauge biopsy needles. However, the proximal thigh muscle layer of large primates is thick, resulting in large puncture resistance and difficult operation. The core operation principle is consistent with iliac crest biopsy: place the animal in lateral position, hold the proximal thigh with the palm, locate the trochanteric fossa at the inner and distal side of the femoral greater trochanter by thumb palpation, insert the biopsy needle toward the femoral shaft to penetrate into the medullary cavity, and complete negative pressure aspiration and specimen collection according to the standard needle operation procedure.

Проксимальний відділ плечової кістки є ще одним ефективним альтернативним місцем взяття зразка. Діаметр довгої кістки плечової кістки більший, а медулярна порожнина ширша й дрібніша, що робить позиціонування біопсійної голки більш точним, а операцію простішою. Покладіть тварину на бік, тримайте проксимальний відділ передньої кінцівки, пропальпуйте міжгорбкову борозну між великим і малим горбиками плечової кістки, введіть біопсійну голку в бік діафіза плечової кістки, щоб увійти в медулярну порожнину. Це місце має низькі вимоги до точності тіла голки, низький відсоток невдач проколу та підходить для швидкого відбору зразків і групових експериментів на тваринах.

Метод перфузії довгої кістки та глибоке застосування-голки для біопсії

На відміну від звичайної пункції однією-голкою, метод перфузії довгої кістки (Kushida et al., 2000) — це технологія високо{3}}чистого відбору зразків кісткового мозку, придатна для високо-точних експериментів, що вимагає спільного використання двох голок для біопсії кісткового мозку. Під час операції потрібно вставити відповідні голки для біопсії в медулярну порожнину на обох кінцях стовбура довгої кістки відповідно, повільно ввести стерильний фізіологічний розчин через одну голку для біопсії та зібрати перфузат кісткового мозку-, який містить, у стерильний закритий контейнер через подовжуючу трубку, з’єднану з іншою голкою. Цей-режим кооперативного відбору проб із подвійною голкою ефективно запобігає забрудненню периферичної крові під час звичайної пункції, а отримані зразки кісткового мозку мають вищу чистоту, що підходить для розділення стовбурових клітин, культивування in vitro та високо{9}}точних експериментів з виявлення оміків.

Диференційована операція аспірації кісткового мозку та кор-біопсії на основі біопсійних голок

Для аспірації кісткового мозку та серцевої біопсії використовується одне й те саме місце забору та обладнання для біопсійної голки, але логіка післяопераційної операції з голкою абсолютно різна, що визначає два типи експериментальних зразків: рідку рідину кісткового мозку та тверду тканину серцевини кісткового мозку. васпірація кісткового мозку, після того, як голка для біопсії буде зафіксована в медулярній порожнині, витягніть стилет і підключіть шприц, щоб застосувати негативний тиск для вилучення рідкої рідини кісткового мозку, яка використовується для підрахунку клітин, морфології мазка та виявлення проточною цитометрією.

всерцева біопсія кісткового мозкузосереджуючись на зразках тканини, після витягування стилета біопсійна голка Jamshidi просувається далі на 1–2 см у медулярну порожнину шляхом стабільного тиску та повільного обертання. Спіральний ріжучий край на кінчику голки може повністю охопити серцевину кісткового мозку. Потім послабте корпус голки, обертаючи та розгойдуючи, злегка втягніть і вставте знову, щоб відокремити нижню частину основної тканини від кісткової трабекули. Переконавшись, що тканина повністю відокремлена, витягніть біопсійну голку повністю обертальною тракцією. Нарешті, виштовхніть неушкоджений твердий зразок серцевини кісткового мозку з порожнини голки за допомогою лінійного штовхача та зафіксуйте його 10% формаліном для зрізу тканини та патологічного аналізу.

Висновок

Стандартизоване застосування голок для біопсії кісткового мозку є основним ключем до успіху експериментів із пункцією та біопсією кісткового мозку приматів, відмінних від людини. Біопсійна голка 14G Jamshidi з оптимізованою конструкцією та стабільною продуктивністю відбору зразків є кращим обладнанням для біопсії NHP. Дослідники повинні вибрати специфікації голки відповідно до типу тіла тварини та експериментальних цілей, суворо дотримуватися протоколів попередньої обробки гепарином, стерильності та чергування ділянок, а також оволодіти диференційованою технікою операцій аспірації та біопсії. Стандартизований вибір і робота голок може ефективно покращити чистоту та цілісність зразків, зменшити травми тварин і експериментальні помилки, а також забезпечити надійну технічну підтримку для доклінічних досліджень гематології та трансляційної медицини на моделях не-приматів людини.